研究简介:糖尿病、血压疾病、超重的发病率不断上升以及人口寿命的延长是慢性伤口（尤其是下肢伤口）逐年增加的部分原因。迄今为止，医生使用的最可靠的治疗方法之一是锐性清创和去除死亡和感染的组织。然而，由于清创术很少能清除所有微生物，因此任何残留的细菌都可能重新繁殖伤口。为了开发新的伤口护理疗法，良好的体外模型是必要的。模型越真实，从实验室规模的体外模型获得的数据转化为体内条件并且治疗在实践中取得成功的可能性就越大。本研究中的修改模型基于Chen等人最近发表的分层慢性伤口生物膜模型(CWB)，其中包含金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。首先基质材料从琼脂变为胶原，从而从植物来源变为哺乳动物、人类相关材料。研究人员假设改变基质可能会影响抗菌素耐受性。其次模型是在Transwell插入物中铸造的。这允许在不引入剪切流的情况下从底部交换营养物和废物。据推测，这将使模型能够在更长的时间内维持生长，并在细菌数量和物种间比率方面保持稳定状态。第三将原始模型中的生理盐水替换为磷酸盐缓冲盐水（PBS）。研究人员通过制作这种新的、改良的体外模型的动机是创建一个类似伤口的微环境，在这种微环境中可以在类似体内的条件下测试新颖的局部产品。通过培养与伤口相关的病原体，同时模拟多种环境因素，例如pH值、氧气和温度水平以及营养物质的持续供应，因为这些因素对潜在的治疗有很大影响。该模型使用易于采购的材料在经济上可行，并且易于复制，从而为新伤口治疗的半高通量筛选提供机会。


Unisense微电极系统的应用


使用unisense电化学微传感器进行氧气和pH值测量。pH微电极和参比电极的传感器尖端直径均为100μm（PH-100,Unisense A/S），氧气微电极的传感器尖端直径为25μm（OX-25，Unisense A/S，)。传感器连接至微传感器万用表(Unisense A/S)，并由运行Sensortrace Suite软件(Unisense A/S)的PC控制。微传感器尖端位于模型空隙的中间，并以100μm的垂直增量记录信号，直到1100μm的深度。测量过程中，模型被放置在恒温加热块上，保持在33°C。


实验结果


提出了现有体外模型的修改版本，该模型满足“理想”体外感染慢性伤口模型的八项拟议标准。它包含WSM，它基于提供半固体环境的胶原蛋白基质，连续添加营养物质而不在模型内产生剪切流，它表达了几种类型的3D梯度，并且它的表面不包含非哺乳动物成分或固体表面。生物膜可以生长。建立的模型在6天内保持了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的稳定比例。此外，它表现出pH值≥8.0的碱性条件和陡峭的氧气梯度，导致缺氧微环境，这与慢性伤口中观察到的条件相似。因此，它提供了一个支架，可以在类似体内的条件下测试局部伤口治疗。测试的三种局部水凝胶均显示CFU数量显着减少。此外，它们降低了pH值，导致酸性条件，并减少了细菌耗氧量，这都是局部伤口愈合产品所需的品质。仅通过评估存活的病原体来衡量新抗菌治疗的效果是很常见。

图1、改良的分层慢性伤口生物膜模型示意图。

图2、未经处理模型随时间变化的pH值和氧通量率。图A中显示了所有pH深度剖面(n=9)的单个值、平均值和标准偏差。图B中显示了氧气通量速率(n=9)的单个值、平均值和标准偏差。pH值的变化使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较进行测试，包括Dunn校正，以观察每个模型的pH值随时间的显着变化。将第0天的数据与第2、4和6天的数据进行比较。对于O2通量，使用双尾Mann–Whitney U检验进行非参数分析，进行配对比较以确定两个模型之间的显著差异。

图3、CWB模型中随时间变化的pH值和氧气梯度。显示平均值和标准偏差（每个条件和每个时间点n=9）。在第0天，测量新铸造的未经处理的模型作为基线。第2天，观察细菌对未处理模型的pH值和氧气的影响。在第4天和第6天，获得了处理对pH值和氧气梯度的影响以及未处理模型的梯度。

图4、mCWB模型中随时间变化的pH值和氧气梯度。显示平均值和标准偏差（每个条件和每个时间点n=9）。在第0天，测量新铸造的未经处理的模型作为基线。第2天，观察细菌对未处理模型的pH值和氧气的影响。在第4天和第6天，获得了处理对pH值和氧气梯度的影响以及未处理模型的梯度。

图5、第2天(A)、第4天(C)和第6天(E)的mCWB概述。所有天均观察到金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的小菌落：第2天（B）、第4天（D）和第6天（F）。金黄色葡萄球菌=绿色，铜绿假单胞菌=红色，死细菌=蓝色。


结论与展望


本论文研究了一种新的体外慢性伤口生物膜模型，该模型提供了模拟哺乳动物组织成分的分层支架，可以在其上测试局部伤口护理产品。研究人员进一步更新了模型，以模拟营养物质从下方的动态流入，就像慢性伤口的情况一样。改良的体外模型是使用胶原蛋白代替琼脂作为主要基质成分创建的，并且包含金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。该模型被铸造在Transwell插入物中，然后放置在伤口模拟介质中，从而允许营养物质和废物通过过滤器进行交换。使用三种潜在的伤口护理产品和作为阳性对照的二葡萄糖酸氯己定2%溶液来评估模型。测试的产品由携带不同活性化合物的完全生物降解淀粉微球制成的水凝胶组成。将化合物局部涂抹并放置2-4天。使用unisense微电极剖面分析系统测量氧气浓度和pH值，以评估处理对细菌活性的影响。获得模型的共焦显微镜图像以可视化微菌落的存在。研究结果表明，改良的体外模型在6天内保持了两种细菌种类的稳定数量。在未经处理的模型中，形成陡峭的氧气梯度并且pH值增加至>8.0。含有活性化合物的水凝胶可缓解高耗氧量并大幅降低pH值。此外，与氯己定对照处理相比，所有三种水凝胶均显着且更大程度地减少了集落形成单位。修改后的模型表现出与体内慢性伤口相似的几个特征。