龋病是口腔常见的感染性疾病之一。牙菌斑生物膜的形成是龋病形成的首要因素，而变异链球菌则是牙菌斑中主要的致龋菌之一。变异链球菌等产酸细菌通过分解糖类产酸，降低菌斑局部pH使牙面脱矿，最终形成龋损。这些酸性代谢产物是造成牙齿脱矿最直接的原因。目前，检测菌斑基质中pH值主要采用pH染料、微电极等方法，但这些测量方法常为非原位测量的方法，易带入其他混杂因素。


变异链球菌是牙菌斑生物膜中的重要成员，该菌能够代谢糖类产酸，降低局部pH，抑制其余细菌（如血链球菌）的生长，在竞争中逐渐成为优势菌。同时变异链球菌具有耐酸性，可以在低pH的环境中正常生长，并且产生更多的酸，使环境始终处于低pH状态。牙菌斑生物膜形成迅速且较难清除，其中的微生物代谢产生的乳酸等酸性物质不易流出亦不易被唾液中和，故可造成牙菌斑底部附着牙面的局部长期低pH环境。龋病的发生就始于局部低pH环境造成的牙体脱矿。由此可见，相对于细菌本身而言，其产酸造成的菌斑附着表面的低pH环境才是龋病发生的直接因素。如何直观准确地反映菌斑pH显得尤为重要。本实验构建的低pH感应系统以致龋微生物——变异链球菌作为报告菌，可用于与龋相关的微生物及微生态研究，不带入其他影响因素，使用范围广。


目前，生物膜pH的测量方法大致有以下几种。1）接触式电极测量法：将微电极插入待测部位进行探测。2）取样检测法：将待测部位菌斑收集起来，再通过pH计进行检测。这两种方法简单、便宜、灵活，但具有测量时会扰乱待测部位生物膜，测试时间不连续，唾液缓冲作用影响大，非原位检测等缺点。3）内在电极测量法：将微电极事先置于未形成生物膜的物体表面（如义齿基托、培养皿底部等），然后置于患者口内或接入细菌，即可通过无线电技术连续长期地检测pH。这种方法不扰乱生物膜的形成且为原位检测，但其价格昂贵、操作复杂。4）pH染料法：使用商品化的pH荧光染料对生物膜进行染色和检测。此方法中pH染料染色的操作易受生物膜厚度和表面粗糙程度等因素的影响，造成实验误差。总体来说，生物膜pH的测量方法不尽如人意，研究者们渴望寻得一种方便、廉价、连续原位测量且误差较小的测量方法。本实验构建的变异链球菌低pH感应系统，于生物膜原位检测pH，检测方法操作简单，可最大程度还原生物膜局部的真实pH高低状态，减少人为因素带入的影响。

不同pH和处理时间变异链球菌低pH感应系统单位面积荧光强度统计图

唾液链球菌尿素酶编码基因ureⅠ的启动子pureⅠ酸诱导性强，机制较清楚。CodY蛋白与RNA聚合酶竞争pureⅠ上的结合位点，而pH的高低则决定CodY蛋白与结合位点的结合与解离。本课题组发现，变异链球菌中的CodY蛋白与唾液链球菌中的CodY蛋白高度同源，且有研究者将该启动子转入格氏链球菌中并验证了该启动子在链球菌属其他菌种中也可以正常发挥酸诱导特性。研究中展望了使用该启动子连接一段报告基因以制作生物膜pH探针的应用前景。GFP具有荧光稳定，非种属特异，不影响细胞正常生理功能，可用于活细胞直接观测等特点，其编码基因常被作为报告基因用于启动子功能验证，报告菌株构建，蛋白质定位以及分泌的检测等，也曾被用于变异链球菌中研究gtfB基因的表达调控。故本实验将启动子pureⅠ与gfp基因连接转入变异链球菌中，从而构建受环境pH调节荧光强弱的变异链球菌低pH报告系统。该系统感受环境pH的受体位于核酸层面，调控精度高，从而提高了此系统的准确性。


本研究在变异链球菌低pH感应系统的验证中发现，培养14 h后的生物膜样本已检测出较弱荧光，但荧光强度明显低于处理后。笔者认为，造成此现象的原因可能是：1）由于变异链球菌代谢产酸，虽已使用50%BHI培养基降低营养，并于培养基中加入酸碱缓冲剂Pipes，但经检测培养14 h后培养基仍处于弱酸性；2）质粒在变异链球菌中为多拷贝状态，而变异链球菌基因组codY基因为单拷贝。变异链球菌产生的CodY蛋白不足以在接近中性pH的环境下将pureⅠ启动子完全阻遏，故仍可有GFP的合成。本课题组后期实验计划将融合片段pureⅠ-gfp整合到变异链球菌基因组中，以期具有更精确灵敏的pH感应作用。


综上所述，本研究成功构建了变异链球菌低pH感应系统。该系统可在一定的范围内原位反映生物膜局部pH状态，具有一定的应用前景。同时，本研究验证了唾液链球菌尿素酶基因的启动子pureⅠ在变异链球菌中可以正常发挥酸诱导功能，为日后进一步将该启动子应用于变异链球菌基因表达调控的相关研究提供了理论基础。