近年来，随着多学科交叉的深入发展及微纳加工技术的进步，微流控技术在生命科学、医学检测领域得到广泛应用。由于微流控芯片具有小型化的特点，特征尺寸与细胞尺度相近、成本低、结构设计灵活且易于与其他检测分析手段集成，因此被广泛用于单细胞分析。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也称为出芽酵母，作为一种重要的模式生物，在现代生物学研究中具有重要意义。而微流控芯片则为酵母单细胞分析提供了便捷又精准的研究平台。


目前，微流控芯片中酵母细胞的监测方法主要是光学显微成像技术。通过高分辨显微镜能够获得出芽酵母单细胞的形态、尺寸、生长速率、子细胞剪切等信息。利用荧光蛋白标记亚细胞结构(液泡、细胞核、线粒体等)，还能获得酵母细胞内部结构的动态变化。然而，高分辨率时序显微成像技术的通常需要荧光标记，对细胞的正常生理过程存在一定的影响；此外，大批量的图像处理耗时耗力。


相比于显微成像技术，电阻抗谱(Electrical impedance spectroscopy，EIS)具有非侵入性、无需荧光标记、快速检测、多参数读取等特点。电阻抗谱检测功能可通过微电极集成在微流控芯片中，通过检测单细胞的介电特性表征细胞尺寸、生长状态等。例如，Haandbaek等在微流控芯片中集成微电极，并根据电阻抗信号对流经微流体通道的酵母细胞的出芽状态进行区分。Zhu等提出一种可以捕获酵母单细胞的微流控芯片，并通过电阻抗对单个出芽酵母的生长及运动进行监测、区分。然而，现有的研究成果还无法实现对出芽酵母的高通量、长时间的EIS监测。因此，用于出芽酵母长时间培养、原位时序电阻抗监测的高通量微流控芯片尚待研究。


本研究提出一种集成高通量酵母单细胞捕获结构及微电极阵列的微流控芯片，建立微流控芯片及酵母细胞的三维有限元模型，分析模型内电流分布情况以及不同行列间距下邻近细胞对于待测细胞EIS信号的影响。考虑到阵列集成度及检测灵敏度的需求，根据仿真分析结果探索微电极阵列的最优行列间距，对基于电阻抗谱的微流控酵母检测芯片的设计优化具有重要意义。


1原理和方法


1.1微流控芯片的结构及工作原理


如图1(a)所示，微流控芯片由玻璃衬底、铬-金微电极阵列、氮化硅绝缘层、SU-8光刻胶捕获-剪切结构等组成。微电极阵列是酵母细胞EIS检测的核心结构。如图1(b)、图1(b)所示，微电极阵列由列电极(红色部分)和行电极(蓝色部分)交叉排列而成，SU-8捕获-剪切结构则分布于每个行列电极交叉处。所有行列电极宽度均为10μm。列电极与行电极表面有一层氮化硅绝缘层，在捕获-剪切结构上下游分别形成长为15μm，宽为8μm的圆角矩形开孔，用于对出芽酵母的电阻抗检测。氮化硅绝缘层能够有效避免微电极阵列间的电流串扰，提高电阻抗检测的灵敏度。每个捕获-剪切结构以及与之对应的绝缘层开孔处的微电极对即为一个酵母细胞的捕获检测单元。相邻捕获检测单元的列间距设为Δx、行间距设为Δy。如图1(b)、图1(c)所示，捕获-剪切结构由2根对称的SU-8微柱组成，微柱高为8.3μm，2根微柱的下游开孔宽度为3μm，与上下游氮化硅开孔距离均为6μm。图1(c)为捕获检测单元沿AA′的截面示意图，行列电极的厚度均为0.2μm，氮化硅层的总厚度为1μm。具体地，列电极位于玻璃衬底表面，行电极位于厚度为0.5μm的第一层氮化硅上表面。

图1微流控芯片几何结构图


如图1(b)所示，出芽酵母细胞以出芽方式进行增殖。母细胞被流体动力固定在捕获-剪切结构中，子细胞在下游开孔外出芽生长，并最终被流体剪切去除。SU-8捕获-剪切结构、被捕获的出芽酵母细胞以及周围的培养液构成一个等效电路系统，酵母细胞的生长以及子细胞的剪切均会改变系统的电阻抗。通过捕获检测单元上下游的微电极对可以实现对系统电阻抗的检测，其原理是对上游激励电极施加幅值固定的交流电压并记录下游响应电极的电流响应，基于欧姆定律计算出系统的电阻抗。幅值、频率一定的激励信号记为，响应电流记为，则该系统的复阻抗为:

对捕获检测单元中的出芽酵母进行电阻抗检测时，施加激励信号至与之对应的列电极，并检测相应行电极的响应电流信号。按照行列寻址的方式选择不同的行列电极组合，能够实现阵列中所有出芽酵母的电阻抗检测。根据式(1)，在激励信号不变的情况下，响应电流的变化能够反映系统复阻抗的变化，进而揭示待测出芽酵母的相关信息，如细胞的尺寸变化、子细胞的剪切等。