背景介绍:随着水体的富营养化，带有微藻附生生物膜的海草叶过度生长会增加，由于包括农业在内的土地径流加速，这在沿海水域中是一个日益严重的问题。富营养化的增加会导致海草叶片的附生植物过度生长，这对沿海水域的海草健康构成了重大威胁。然而对于附生植物如何影响海草叶球的关键生物地球化学条件和过程知之甚少。本论文的研究人员使用电化学微传感器来测量裸露和附生植物覆盖的海草叶表面的O2，pH和CO2的微梯度浓度，以确定附生植物对叶片化学微环境的影响。研究人员使用unisense的微电极剖面分析系统测量来确定附生生物膜对大叶藻叶片微环境中关键物理化学条件和过程的影响。研究表明在没有和有附生微藻生物膜的情况下，首次实现了直接测量在没有和有附生微藻生物膜的海草叶片表面二氧化碳浓度和动态的直接测量，并与pH和O2的微剖面浓度测量相结合。这对附生植物对海草叶球微环境的影响的详细测定是非常新颖的，并且使人们能够洞察富营养化引起的附生植物过度生长下海草光合作用的关键调控机制。


Unisense微电极分析系统的应用


使用unisense的Clark型O2微型传感器（OX-10，尖端直径10μm，响应时间（1-3 s），用于测量从水到叶片组织表面的O2浓度曲线。pH微电极（pH-50，尖端直径50μm）测量从水到叶片表面的pH分布。在三个pH缓冲液（pH 4、7和10）中根据信号读数对pH微电极进行线性校准，pH微电极与浸没在流动室中的参比电极（REF-RM；Unisense A/S，丹麦）结合使用。新型的Clark型CO2微电极传感器（尖端直径为20–100μm，检出限<0.5μM，响应时间为160s）用于测量叶片表面的CO2浓度。CO2微电极传感器在预先吹扫过的氮气（N2）超纯水，酸性（pH<4）超纯水和已知CO2浓度（即0、37、74和111μM）的超纯水水中进行线性校准（四点）。


所有微电极传感器都连接到unisense主机上，并安装在电动微操纵器（MM332）上。在进行微剖面浓度分析之前，通过手动操作微操纵器将微传感器定位在叶片表面，同时用立体显微镜观察微传感器的尖端和叶片组织表面。当微传感器尖端接触到植物组织表面时，叶片略有移动。其中O2微电极的移动步径为50μm，pH、O2微电极的移动步径为50μm，CO2的移动步径为为100μm。由于CO2微型传感器的响应时间相对较长，因此在厚附生层中选择了200?m步径。剖面测量从叶片表面上方2–3 mm的混合水柱开始（取决于DBL的厚度和附生生物膜的厚度）朝向叶片组织的表面。为了在微剖面分析时确保稳态条件，当改变光照条件时，将微电极传感器放置在叶片表面，并随时间跟踪微传感器信号，直到达到新的稳定信号为止（大约45分钟）。


实验结果


附生植物生物膜会导致pH，O2的极端波动，而海草叶片表面无机碳浓度严重影响了植物的生长性能。在光照条件下，叶片附生生物膜及其扩散边界层会导致强碱化作用，显著降低叶片表面的CO2和HCO3可用性，导致碳限制和光呼吸作用增强导致光合效率降低。对于附生植物，叶片表面的pH值增加到>10，从而超过最终pH值平均水平（?9.62）和活性光合作用的CO2补偿点。在黑暗中，附生生物膜导致CO2增加叶片表面缺氧。附生植物会导致海草中严重的碳限制，这是由于叶球碱化作用强烈，导致二氧化碳消耗和昂贵但限制了HCO3-的利用，增加了植物饥饿的风险。

图1、微电极系统测试大叶藻叶片的表面的实验装置图。（a）实验装置的图像显示无附生植物生物膜和有附生生物植物膜的海草（Z.marina L.）叶片效果图，以及Clark型O 2微电极传感器的尖端。（b）概念图表示的是穿过扩散边界层(DBL)和附生海草生物膜的O 2，CO2，HCO3-，pH剖面，以及假设附生植物在光照下对叶片微环境碱化的影响，从而对海草光合作用的无机碳（CI）有效性的影响。在这里，从海水到海草叶表面的总扩散距离（TDD）等于附生生物膜和真实DBL的总厚度（即生物膜/海水界面处稀薄的未搅拌水层）。

图2、在没有附生生物膜和有附生生物膜的叶状球的海草的化学参数（O2、CO2、pH）微梯度。在入射光子辐照度(400-700 nm)为0、30和300 mol光子?m-2?s-1的情况下，测量/计算了叶片表面的O2、CO2和pH的垂直浓度剖面(以及推导出的HCO3‐的浓度剖面)。黑色符号和线条表示没有附生植物覆盖的叶子（裸露的对照叶子；?附生植物）。红色符号和线条表示带有附生植物覆盖物（+附生植物）的叶子。零距离（y=0）表示叶片组织表面。总扩散距离的厚度确定为真实扩散边界层中线性O 2浓度梯度与外推的散装水O 2浓度相交的位置（图1；在黑暗中和在300 mol光子?m-2?s–1下的O 2测量值之间的平均值?m?2?s-1，表示附生生物膜的大致厚度（黑色虚线；总扩散距离）。

图3、叶片附生生物膜对大叶藻叶片表面化学微环境的影响（a和b）选定的微剖面显示了O2（黑色），CO2（蓝色），pH（红色）的垂直浓度的动态变化），以及所估计的HCO3-（绿色）。在入射光子辐照度(400-700 nm)为0、30和300 mol光子?m-2?s-1的情况下，测量计算了叶片表面的O2、CO2和pH的垂直浓度剖面(以及推导出的HCO3‐的估计浓度剖面)。总扩散距离的厚度确定为真实扩散边界层中线性O 2浓度梯度与外推的散装水O 2浓度相交的位置。

图4、附生植物诱导海草宿主的大叶藻微环境动力学。在无附生生物膜和有附生生物膜的大叶藻叶片组织表面测量的pH值和O2、CO2和HCO3浓度的动态范围，在光子照射(400-700 nm)强度从0-300 mol光子?m-2?s–1，黑条表示没有附生植物覆盖的叶子（裸露的对照叶子；?附生植物）。红色条代表带有附生植物覆盖物（+附生植物）的叶子。

图5、附生生物膜厚度对pH值和无机碳有效性的影响。大叶藻叶片表面的CO2浓度和估算的HCO3‐。总扩散距离的厚度被确定为真正扩散边界层中线性的O2浓度梯度与外推的体积水O2浓度之间的距离。在0(黑色符号)、30 umol光子?m-2?s–1(蓝色符号)和300 umol光子?m-2?s–1(红色符号)的摩尔光子辐射下，测量了海草叶片表面pH值和CO2和HCO3‐浓度对扩散距离的响应。


结论与展望


研究人员通过使用unisense的微电极剖面分析系统测量来确定附生生物膜对大叶藻叶片微环境中关键物理化学条件和过程的影响。使用unisense微电极传感器来测量裸露和附生植物覆盖的海草叶表面的O2，pH和CO2的微梯度，以确定附生植物对叶片化学微环境的影响。研究了在没有和有附生微藻生物膜的情况下，首次实现了直接测量在没有和有附生微藻生物膜的海草叶片表面CO2浓度和动态的直接测量，并与pH和O2的微剖面浓度测量相结合。这种对附生植物对大叶藻叶球微环境的影响的详细测定，该研究使研究人员能够洞察富营养化引起的附生植物过度生长下海草光合作用的关键调控机制。