材料和方法


来自葡萄园的浆果


浆果来源、葡萄树龄、采样时间和相应测量的详细信息列于表1中。来自Waite Campus（34°58'04.8'''S,138°38'07.9''''E）葡萄园的浆果在2014-2015、2015-2016和2016-2017季节采样。成熟的设拉子、霞多丽和红宝石无核葡萄藤在标准的葡萄园管理下生长在自己的根上，垂直枝条定位，修剪枝条（两个芽），在带有页岩碎片的深棕色粘土上滴灌，分级为红棕色斑驳粘土;覆盖在橄榄褐色斑驳的开裂粘土上（Du Toit,2005）。行（3 m间距）是南北向的。三个重复每个由两个葡萄藤组成，每个重复的设拉子和三个葡萄藤的霞多丽。在每个重复中标记10个随机簇（近端和远端的组合），每个重复在09:00之间的每个采样日期在花梗-轴交界处用锋利的剪刀切下20个浆果（每个簇中的两个，随机位于簇内）小时和11点。红宝石无核葡萄从三个葡萄藤中取样，每个葡萄藤上有五个标记用于取样的簇，并且从每个葡萄藤中取样20个浆果。浆果发育过程中的采样时间以开花后的天数来衡量（DAA，50%的花冠从花上掉下来）。浆果用密封塑料袋装入冷却容器中，带回实验室，4℃避光保存，取样后48小时内进行检测。


表格1 浆果来源和性状的总结


来自盆栽葡萄树的浆果


Shiraz和Chardonnay扦插于2015年4月从Waite葡萄园采摘，并在4°C黑暗中储存约2周后繁殖。繁殖方法和葡萄藤营养管理基于Baby等人。(2014)。简而言之，在4°C冷室中的加热沙床中开始生根8周后，根长达到~6 cm后，将插条转移到12 cm盆中的蛭石:珍珠岩(1:1)混合物中.将花盆放置在具有16小时光周期、400μmol光子m的生长室中–2 s–1)植物水平、27°C白天/22°C夜晚和50%湿度。用半强度的Hoagland溶液灌溉花盆（Baby等人，2014年）。在EL-12阶段（葡萄藤Coombe，1995年）结果实的随后被转移到加州大学(UC)的土壤混合物中：61.5升沙子、38.5升泥炭苔藓、50克氢氧化钙、90克碳酸钙和100克Nitrophoska®（12:5:1，N:P:K加微量元素；Incitec Pivot Fertilisers，南岸，维多利亚州，澳大利亚），每100升pH值为6.8，在20厘米直径（4升）灌溉盆中之后用水。每个栽培品种的五个浆果（每个来自三个不同的葡萄树）用于光学立体显微镜检查。


霞多丽幼苗于2017年4月从Yalumba Nursery获得，并用UC混合土壤种植在相同的生长室中，生长条件与上述相同。七株葡萄藤，每株一簇，用于O 2扩散实验。


[氧气    ]浆果中的轮廓


浆果[O 2]使用的克拉克型O 2尖端直径为25?m微电极（OX-25；Unisense A/S，奥尔胡斯，丹麦）进行测量。微电极在零O中校准2溶液（0.1 M NaOH、0.1 MC 6 H 7 NaO 6）和充气Milli-Q水（272?mol l）–1 22°C下为为100%O 2溶液。单个浆果（平衡至室温）固定在电动显微操作台上。为了帮助微电极穿透浆果皮肤，在浆果赤道处用不锈钢注射器针头(19 G)轻轻刺穿皮肤，深度为0.2毫米。微传感器通过这个开口被放置在浆果中，并且[O 2]分布是朝着浆果中心的深度采集的。对于设拉子，在皮下0.2毫米至1.5毫米处以0.1毫米的增量进行测量。电极没有移动超过该点以避免损坏尖端对种子。对于不存在种子的Ruby Seedless和不存在种子或可通过半透明表皮确定种子位置的Chardonnay葡萄，从皮下0.2 mm到可以确定种子位置的间隔为0.5 mm进行测量。浆果中心。每次测量在每个深度应用10秒的持续时间。在每个位置之间，应用了20秒的等待时间以确保稳定的信号。为了测试针刺皮肤和插入微电极是否会被污染浆果内部O 2周围的空气，在插入部位周围放置一个塑料环，并注入温和流(250 ml min–1的氮气)在获得O同时将其施加到插入点2读数的（图1A）。将这些读数与未施加氮气的读数进行比较。

图1


[O[O 2 2]霞多丽浆果（2016-2017年产季为90 DAA，Waite葡萄园）的]分布图，使用和不使用N 2在测量过程中在入口点气体进行测量。插图：用于测量浆果[O实验装置2]剖面的（不按比例）。将O 2传感器（尖端直径25?m）插入浆果的赤道处，并大约穿过半径向内移动到中心。在传感器的入口周围，一个塑料环被密封并粘在浆果上，以容纳轻轻流到传感器入口点的氮气。数据是平均值±SE，n=3。双向方差分析（重复测量）显示，深度占总变异的68.73%（P<0.0001），处理占总变异的0.55%（P=0.26），交互作用占总变异的3.72%（P=0.87）。


[O 2]霞多丽浆果（2016-2017季节的90 DAA，Waite葡萄园）的[O2]分布图，在测量过程中在入口点使用和不使用N2气体进行测量。插图：测量浆果[O2]剖面的实验装置（不按比例）。将O2传感器（尖端直径25?m）插入浆果的赤道，然后向内移动到大约整个半径的中心。在传感器的入口周围，一个塑料环被密封并粘在浆果上，以容纳轻轻流到传感器入口点的氮气。数据是平均值±SE，n=3。双向方差分析（重复测量）显示，深度占总变异的68.73%（P<0.0001），处理占总变异的0.55%（P=0.26），交互作用占总变异的3.72%（P=0.87）。


O 2使用Unisense Suite软件(Unisense A/S)记录读数。每个生物重复测量三个浆果。每个步骤的平均值和SE(n计算=3)并[O 2使用GraphPad Prism 7(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)编译]分布。在O 2测量之后，使用带有K型热电偶珠探针（Fluke 80PK-1）的IR温度计（Fluke 568，Fluke Australia Pty Ltd，NSW，Australia）记录浆果温度。赤道的浆果直径是用数字卡尺测量的。[O 2]和呼吸（见下文）在昏暗的房间照明下测量，<1μmol光子m–2 s–1。测定浆果活力（见下文），并使用数字折光仪（日本东京爱宕）作为浆果成熟度的指标测定单个浆果汁液的总可溶性固形物(TSS)。


测试花梗皮孔的作用


[O 2]如上所述测量，但探针沿浆果中心轴固定在距花梗约2毫米处。获得稳定读数后，N 2气（250 ml min–1然后将）施加到花梗上，以测试花梗皮孔对O的贡献2扩散到浆果中。


浆果和种子呼吸O 2消耗


Clark型氧微传感器OX-MR和MicroRespiration System(Unisense A/S)用于浆果和种子呼吸测量。一个复制品由九个浆果组成。测量室充满充气的MilliQ水，不断搅拌，并在水浴中保持在25°C。在测量整个浆果的呼吸后，提取九个浆果的种子并使用相同的设备测量种子呼吸速率。室内水[O 2监测]的变化至少15分钟，每5秒读取一次读数，以便根据[O下降的斜率确定稳定的呼吸率2]。


还测量了设拉子和霞多丽浆果在用硅脂（SGM494硅脂，ACC Silicones Limited，Bridgewater，UK）覆盖花梗之前和之后的呼吸作用，已知该硅脂会限制浆果花梗吸水（Becker等人，2012年）,在20°C和40°C。另一批九个霞多丽浆果用于确定切除花梗的呼吸作用。


浆果呼吸的温度依赖性是通过保持在10、20、30和40°C的水浴来确定的。


花梗皮孔密度


使用带CCD相机的Nikon SMZ 25立体显微镜（Nikon Instruments Inc.,Melville,NY,USA）评估霞多丽和设拉子浆果花梗（茎和容器）的皮孔密度。使用ImageJ（估计豆瓣面积(%)Schneider等人，2012年）通过首先调整图像的颜色阈值以将花梗与背景分开，然后将皮孔与花梗分开来。随后，使用感兴趣区域(ROI)管理工具来估计花梗和皮孔的相对面积。


阻断花梗皮孔的远期效果


在成熟开始时（浆果软化的最初迹象），每串生长箱式霞多丽上大约一半浆果的花梗都覆盖有硅脂。在施用后第3、5、7、10、12、14和18天，在整个实验过程中随机取样两或三对浆果，每对含有来自一株植物的一个覆盖和一个未覆盖（对照）花梗.浆果[O 2]的分布如上测量，随后评估浆果的细胞活力（见下文）。在有机硅应用后12天和20天对三对浆果进行取样，并评估内部乙醇浓度（见下文）。


浆果乙醇浓度


在液氮下将单个浆果研磨成细粉。按照制造商的说明（Megazyme International Ireland Ltd,Wicklow,Ireland）使用乙醇测定试剂盒对乙醇进行定量。简而言之，乙醇脱氢酶(ADH)催化乙醇氧化为乙醛。然后在醛脱氢酶(AL-DH)和NAD的存在下将乙醛进一步氧化成乙酸和NADH+。在FLUOstar Omega读板器（BMG LABTECH GmbH，Ortenbery，Germany）中在340 nm处测量NADH的形成。


果皮细胞活力评估


如详细介绍的，使用荧光素二乙酸酯（FDA）染色程序对浆果的切割内侧纵向表面进行了Tilbrook和Tyerman（2008年）评估以及Fuentes等人。(2010)。使用MATLAB(Mathworks Inc.,Natick,MA,USA)代码分析图像以确定浆果细胞活力(Fuentes et al.,2010)。使用ImageJ，分析了赤道半径上的FDA荧光信号。检查了[O之间的相关性2]与霞多丽和红宝石无核浆果内相应距离处荧光信号。也以这种方式分析了有或没有花梗覆盖的生长室生长的霞多丽浆果的荧光信号。


浆果内的空气空间


在2015-2016季节期间对霞多丽浆果进行了micro-CT采样，其中每个采样时间使用三个浆果，每个浆果来自不同的重复。在Adelaide Microscopy的微型CT设备中使用Skyscan 1076（Bruker micro-CT，比利时Kontich）对葡萄进行成像，其中整个浆果（附有花梗）具有59 kV、149?A、Al 0.5 mm的二维投影过滤器、2356 ms曝光、0.4°旋转步长和8.5?m像素大小（相当于15?m空间分辨率或3×10–6 mm 3体素大�。�。NRecon(bruker-microct.com)用于灰度图像重建。使用CT-Analyer(bruker-microct.com)，将Otsu阈值应用于体积，并应用去斑以仅接受超过500个体素的连续体积作为连接的空气空间。使用CTVox(bruker-microct.com)生成内部空气空间的三维图像；显色�？橛糜谇帜诓靠掌寤徒寤�。然后将3-D模型纵向剖切以显示内部空气空间分布。通过手动选择感兴趣的体积并接受500个体素作为空气空间，对浆果近端区域和种子顶部（种脐）之间的内部孔隙度进行定量分析。


统计分析


所有数据均表示为平均值±SE。双向方差分析用于：O 2传感器深度和施加N 2在传感器入口处气体对[O 2]的影响、O 2传感器深度和成熟阶段对[O 2]的影响、温度和覆盖皮孔对呼吸的影响、温度和葡萄成熟度对呼吸Q 10的影响、覆盖皮孔的影响和覆盖持续时间对[O 2]、TSS、每个浆果的糖分、乙醇和活组织特征。Deming回归用于确定FDA染色的荧光强度与[O之间的关联2]；这种类型的回归考虑了的误差x和y（Strike,1991）。t检验用于以下方面的差异：两个成熟阶段霞多丽的浆果和种子的呼吸作用、霞多丽和设拉子之间花梗上的皮孔面积O活化能2的、霞多丽和设拉子浆果吸收，以及霞多丽的孔隙度和连通性指数两个成熟阶段。使用线性回归确定皮孔覆盖的浆果和对照浆果中CD的比率。


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