材料和方法


凯发app官网登录和地下水收集


凯发app官网登录样本于 2012 年 12 月和 2013 年 7 月从日本广岛大学 (34°24.060 N, 132°42.790 E) 的 Budo Pond 收集。 采样点的特点是在地下水排放点附近有大量的橙色凯发app官网登录（图 1A）。 地下水缓慢流过凯发app官网登录表面，从管道流向开放的池塘。 外框和池底用混凝土覆盖，从而确保管道是池中地下水的唯一来源。 凯发app官网登录分布在距地下水源约 1.5 m 处。 凯发app官网登录的深度为 15-120 厘米，具体取决于其与管道的距离。

图 1 日本广岛大学武道池（A）凯发app官网登录照片。 地下水从管道供应到开放的池塘。 大量的 Fe(III) 凯发app官网登录散布在管道附近。 箭头表示地下水的流动方向。 从图 A 所示的管道（地下水源）30 厘米处收集的 (B) 凯发app官网登录芯的照片。在一系列凯发app官网登录中，颜色明显变化。


通过将丙烯酸管（直径，8 厘米；长度，15 厘米）直接插入凯发app官网登录中来收集两个核心。 在距地下水源 30 厘米处收集两个凯发app官网登录核心。 一个核心用于 16S rRNA 基因分析、矿物物种形成和孔隙水化学表征，而另一个用于微电极和 大麻分析。


从管道供应的地下水（图 1A）与岩心取样的同一天收集。 使用 0.2 lm 膜（Advantec，东京，日本）过滤地下水，并如下所述进行化学分析。


pH、氧化还原电位和溶解氧的微电极分析


凯发app官网登录中的溶解氧 (DO)、pH 值和氧化还原电位 (Eh) 在实验室中使用微电极并按照 Shiraishi 等人描述的方案进行测量。 (2010)。 DO 和 Eh 电极购自 Unisense (Aarhus, Denmark)。 pH 电极按照 Gieseke & de Beer (2004) 的描述制备。 用于微电极分析的凯发app官网登录核心在凯发在线app下载的实验室中在室温下储存约 1 小时，以允许在样品运输过程中可能被搅动的颗粒沉降。 使用电动显微操作器 (Unisense) 以 1 mm 的间隔进行从 0 cm（水-凯发app官网登录界面）到 4 cm 深度的微电极测量。 在凯发app官网登录深度低于 4 cm 时，通过将微电极直接水平插入岩心采样器塑料体上的小孔中，以 2 cm 的间隔进行微电极测量。 DO微电极的检测限为0.3 lM。


孔隙水取样和化学分析


在缺氧室（Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI, USA; Ar:H2 = 98%:2%; [O2] < 0.01 ppm）。 然后通过使用 0.2-lm 膜过滤器 (Advantec) 的真空过滤将所得样品分离为孔隙水和凯发app官网登录相。 收集孔隙水后，根据 Fadrus & Maly (1975) 描述的方案，通过 1,10-菲咯啉方法通过分光光度法测量溶解的 Fe2+ 浓度。 在缺氧室中，从凯发app官网登录中分离出的孔隙水立即与醋酸铵缓冲液中的 1,10-菲咯啉混合。 使用分光光度计（Thermo Scientific GENESYS 20；Thermo Fisher Scientific Inc.，Osaka，Japan）在 510 nm 波长处测量红色溶液。


剩余的孔隙水用于测定无机和有机离子浓度。 使用离子色谱仪（Dionex ICS-1100；Thermo Fisher Scientific Inc.）鉴定主要阳离子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+）和离子（Cl–、硫酸根和NO?3）。 使用电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICP-AES SPS3510；SII Nano Technology Inc.，Tokyo，Japan）测定溶解的 Mn2+ 浓度。 碱度通过 Gran 滴定法用 0.1 M HCl 测定。 通过 Ijiri 等人描述的方法测量乙酸盐浓度。 (2012) 使用同位素比监测液相色谱质谱仪，其中包括连接到 Thermo Scientific LC IsoLink 的 Thermo Finnigan DELTAplusXP 同位素比质谱仪 (IR-MS)。


镁浓度和稳定同位素分析


凯发app官网登录中孔隙水浓度在 0-10 cm 范围内的所有深度进行测量。 此外，在7 cm以下的深度测量孔隙水的碳和氢稳定同位素，以阐明凯发app官网登录中形成甲烷的途径。 将大约 6 g 切片的湿凯发app官网登录插入 20 mL 血清瓶中，并向瓶中加入 1 mL 饱和氯化汞以阻止任何微生物活动。 然后用丁基塞子卷曲密封瓶子。 在分析之前，将样品置于热水浴（约 80°C）中 15 分钟，以对凯发app官网登录中溶解的蒸发进行脱气。 对于地下水测量，大约 10 mL 未过滤的地下水被收集到 10 mL 丁基塞血清瓶中。 在用丁基塞进行卷边密封之前，将 1 mL 等分的饱和氯化汞加入瓶中。 用同位素比监测气相色谱质谱仪测定了镁的浓度和稳定同位素组成。 稳定同位素组成由下式计算：

其中 Rsample 和 Rstandard 分别表示样品和内标中的 13C/12C 或 D/H 比率。 分别使用 Vienna Pee Dee belemnite 碳酸盐和 Vienna Standard Mean Ocean Water 作为碳和氢的内标。 本研究中使用的 IRG 配备了一个端口，该端口在氧化为 340 °C 的 340 °C 下选择性捕集蒸发 CMS 以进行 d13C 测量。 对于 d 测量，在 1450 °C 下进行热解，并将产生的样品气体（或 H2）引入 IR-MS。


HCl 可萃取的 Fe 分析


使用两种浓度的 HCl（0.5 和 6 M）并行进行酸提�。粤炕pp官网登录中的 Fe 含量。 在缺氧室中对凯发app官网登录取样后，将切片的凯发app官网登录用无 O2 的 MilliQ 水（Millipore，Tokyo，Japan）洗涤两次，以去除凯发app官网登录中溶解的 Fe2+。 为避免实验过程中 Fe(III) 还原或 Fe(II) 氧化，根据 DO 曲线改变了实验条件。 来自 0-2 厘米深度范围内的凯发app官网登录样品，其中存在好氧到缺氧条件，在室温下进行有氧处理。 2 厘米以下的凯发app官网登录样品，其中存在缺氧条件，在室温下在缺氧室中进行厌氧处理。 样品干燥后，用 5 mL 0.5 M 或 6 M HCl 处理每个深度的两份 10 mg 凯发app官网登录 1 小时。 通过ICP-AES分析溶解的Fe。 溶解在 6 M HCl 中的 Fe 矿物对应于总 Fe 含量 (Poulton & Canfield, 2005)。


大块和表面敏感的 Fe K 边缘 EXAFS 分析 大块 Fe K 边缘 EXAFS 光谱是在 SPring-8（日本兵库）使用光束线 BL01B1 获得的。 测量是使用完全调谐的 Si (111) 双晶单色仪进行的，带有镀镍反射镜，角度为 6.0 mrad。 光束尺寸调整为大约 1 9 0.8 mm2。 通过将赤铁矿的前边缘峰值最大值设置为 7111 eV 来校准能量。 所有样品，包括标准矿物（水铁矿、针铁矿和菱铁矿）和凯发app官网登录样品，均在快速 EXAFS (Q-EXAFS) 透射模式下进行分析，其中 EXAFS 光谱从 6790 到 7680 eV。 湿凯发app官网登录样品安装在混合纤维素酯膜（Millipore，Billerica，MA，USA）上，然后密封在缺氧室中。 样品保存于 ? 分析前 80 °C。 Q-EXAFS 光谱分析三次。 凯发在线app下载的结果证实在测量过程中没有发生光子氧化或还原。


在 CEY 模式下，通过 Fe K-edge EXAFS 分析表面敏感的 Fe 矿物种类。 使用光子工厂（日本筑波）的光束线 BL12C，使用带有 Rh 涂层反射镜的全调谐 Si（111）双晶单色器以 7.0 mrad 的角度进行测量。 Itai 等人描述了本研究中使用的 CEY-EXAFS 技术和设备的详细信息。 (2008)。 CEY-EXAFS 测量是使用 CEY 检测器单元进行的。 石墨电极放置在 CEY 检测器单元的中心，并用金属盒覆盖以保持 He 气氛。 将与用于 HCl 可萃取 Fe 分析的相同的干燥样品分散在一块碳带上。 然后将该胶带贴在一块铝箔上，然后将其放置在石墨电极上。 在测量过程中，高压电源固定在 300 或 400 V。 合成水铁矿的 CEY-EXAFS 光谱被证实与在体透射模式下测量的样品相同。 使用 ATHENA EXAFS 分析软件包 (Ravel & Newville, 2005) 分析所有 EXAFS 数据。


TEM 观察凯发app官网登录的微观结构和矿物学通过 TEM (JEOL JEM-2010, Tokyo, Japan) 进行研究。 无论沉积层的深度如何，样品制备都是在缺氧室中进行的。 将选定层的少量沉淀物转移到无菌的 1 mL 微量离心管中。 将乙醇以一系列分级浓度（30%、50%、70%、80%、90% 和 100%）加入管中。 使用移液管轻轻混合溶液。 每个乙醇浓度脱水10分钟，离心后倾析上清液（2000 9g；2分钟）。 加入100%乙醇后，将一滴悬浮样品置于铜网上。 网格在缺氧室中干燥过夜。 样品在从缺氧室中取出之前进行密封，以防止样品运输过程中 Fe(II) 矿物的氧化。 TEM观察在200kV的加速电压下进行。


使用 16S rRNA 基因克隆文库进行分析


使用乙醇消毒的刮刀将凯发app官网登录样品切片后，将它们转移到缺氧室中的消毒离心管中并储存在 ? 分析前 80 °C。 对代表性层，即 1 和 2 厘米（表层）、4 和 10 厘米深度处的凯发app官网登录混合物进行 16S rRNA 基因分析，以确定微生物群落随着凯发app官网登录层深度的增加而发生的变化。 根据制造商的说明，使用 DNA 分离试剂盒（PowerMax 土壤 DNA 分离试剂盒；MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA）提取 DNA。 使用 530F 和 907R 引物组的通用引物扩增 16S rRNA 基因，从而靶向细菌和古细菌 16S rRNA 基因（Nunoura 等，2012）。 16S rRNA 基因片段通过聚合链反应 (PCR) 扩增（Nunoura 等，2012）。 PCR产物通过凝胶电泳验证并使用MiniElute凝胶提取试剂盒（Qiagen，Tokyo，Japan）纯化。 然后将 PCR 产物转化到感受态大肠杆菌菌株 K12 中。 克隆在 37°C 下孵育过夜，随机选择总共 94 个克隆并测序（3730XL DNA 测序仪；Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA）。


具有 > 97% 同一性的 16S rRNA 基因序列被分组到一个可操作的分类单元中。 使用基于 ARB-SILVA 106 数据库 (www.arb-silva.de) 的 ARB 软件包 (Ludwig et al., 2004) 进行系统发育分析。 细菌和古细菌的系统发育树是使用 MEGA5 的最大似然法构建的（Tamura 等，2011）。

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