摘要


远洋环境中的氧气呼吸速率通常难以量化，因为k8凯发集团的氧气浓度测定方法的分辨率对于在小于24小时的瓶内培养过程中观察到显著的降低是有限的。在这里，k8凯发集团提出了一种新的高灵敏度方法的评估，该方法将可切换微量氧（STOX）传感器与人工降低O2浓度的全玻璃瓶培养相结合。该方法的呼吸速率检测限与O2浓度成反比，对于初始O2浓度为500 nmol L-1的水，检测限降至<2 nmol L-1 h-1。该方法在丹麦沿海水域和海洋缺氧水域进行了试验。事实证明，它还可以在低耗氧率（~7 nmol L-1 h-1）下进行精确测量，并显著减少培养所需的时间(≤14小时）与传统方法相比。该方法提供连续实时测量，允许多种可能性，例如模拟氧气减少速率以获得动力学参数。k8凯发集团的数据显示，海洋细菌的表观半饱和浓度（Km值）比之前报道的低一个数量级，介于66和234 nmol L-1 O2之间。Km值在不同的浮游微生物群落中有所不同，但k8凯发集团的数据表明，在0.5–1 mmol L-1 O2浓度下测量可靠的呼吸速率是可能的，与在完全空气饱和时测量的呼吸速率相当。


介绍


氧是生命的一个关键参数，生物体的呼吸耗氧量作为多个变量的函数已被广泛研究。然而，氧呼吸不仅在生理学方面很有趣，而且是碳的生物地球化学循环和通过任何生态系统的有机物质流动中的一个主要因素。虽然k8凯发集团地球的大部分地区被海水覆盖，但对浮游生物群落呼吸（CR）的直接测量却相对较少。由于用于测定O2浓度的应用方法（例如Winkler滴定法或Clark型传感器）的分辨率低且检测限高（，1 mmol L-1），因此很难通过实验室培养海水来直接测量氧气消耗率[1]。因此，直接呼吸测量在很大程度上被限制在最活跃的上层海洋200 m处，导致数据库在季节、纬度和深度方面存在很大偏差[2,3]。在中层和深�：Ｋ�、贫营养区和天然低氧水域（如氧气最低区（OMZ））中发现的低速率的直接测量基本上是缺失的，k8凯发集团通常依赖于估计值[4–6]。由于缺乏对海洋（150米以下）的微光区和暗区的测量，这两个区域占海洋体积的98%，在光层多余有机物的矿化、储存和埋藏中起着关键作用[7]，影响了k8凯发集团获得可靠的海洋浮游呼吸总体估计值的能力，以及由此得出的全球碳预算[8]。根据从占海洋表面80%的非生产性水生系统[9]获得的有争议的结果，尚未解决的讨论仍在继续。据估计，这些地区的呼吸速率大大超过初级生产力，表明当地净异养[10–12]。另一方面，通过不同类型的数据分析，发现公海的有机碳收支基本上与有机碳平衡[13]。


同样，缺乏氧气最低区水域有氧呼吸过程的详细数据限制了k8凯发集团对其建立和发展的理解和预测能力[14]。此外，为了通过直接测量耗氧量来评估CR率，通常采用较长的孵育时间（$24小时），因为这是不可避免的，因为呼吸率低，技术灵敏度低。然而，长时间的孵化可能会导致群落结构和动态的变化，导致对比率的不切实际的估计[15,16]。因此，需要更可靠、更准确的测量方法，以及常规评估低放射性水域铬含量的新方法。


最近，通过使用改进版的电子传输系统（ETS）酶法测定微型浮游生物呼吸速率[17]，报告了呼吸速率的较低检测限[18]。在相对较短的时间内（在寡养水体中为3至5.5小时），通过还原2-对（碘苯基）-3（硝基苯基）-5（苯基）氯化四氮唑（INT），在体内估计ETS的活性。该方法的分析检出限为64 nmol L-1不溶性福尔马赞晶体（INT-F）。该值相当于80 nmol L-1 O2，使用电子传递系统（R/ETS比率）测量的呼吸速率和酶活性之间的比率（12.8）将ETS活性转化为碳呼吸。因此，通过测量真实的原位生理速率而不是体外潜在呼吸，该方法应超越标准ETS测定的限制。尽管其检测限有所提高，但这类酶法用于呼吸测量的有效性和准确性受到了严重质疑[6]。


近年来，开发了用于高精度测量氧浓度的新型传感器。因此，高分辨率STOX传感器和高灵敏度光学传感器（optodes）是研究水生呼吸的合适且有希望的工具[19][20]。


为了克服与之前在低活性和低氧水域中的呼吸测量相关的技术和方法问题，k8凯发集团开发并验证了一种以低速率直接定量CR的程序。这是使用高分辨率STOX传感器[19]在人为降低的O2浓度下完成的，并假设在低和高O2浓度下的速率是可比较的。需要较低的O2浓度才能达到该方法的最高灵敏度。然而，上述比较无法在低活性海洋水域进行测试，因为在高氧浓度下的吸氧动力学无法用任何标准方法可靠解析。因此，k8凯发集团首先在高活性沿海水域进行了一项比较研究，其中氧消耗率由STOX法和标准温克勒滴定法测定。此后，k8凯发集团使用STOX方法评估来自热带北太平洋东部（ETNP）OMZ的海水中的CR率。此外，k8凯发集团还介绍了各种浮游生物群落从完全有氧条件到几乎零氧条件下的耗氧动力学；探索一个新的，描述不清的，有氧呼吸仍在发生的浓度范围。


材料和方法


道德声明


本研究中使用的三个丹麦地点的水的获取和取样无需特别许可。在“Thomas G.Thompson”号客轮的东热带北太平洋（ETNP）巡航（2012年3月至4月）期间，在墨西哥水域航行、取样和工作，需获得墨西哥政府的许可。对于所有站点和所有实验，均未涉及濒危或受保护物种。

图1。培养瓶。培养用玻璃瓶，容积为1160 mL（注入红色墨水以增加对比度）。A）用于插入STOX传感器的开口（内径8.1 mm）；B）用于压力补偿的长开口玻璃管（内径2.5 mm）（管内注入蓝色墨水以增加对比度）；C）玻璃涂层磁铁（2.5厘米），用于持续搅拌。内政部：10.1371/期刊。波内。0105399.g001


研究地点和抽样


从丹麦的三个不同地点采集海水和微咸水样本（图S1）。在三个季节（2011年6月至7月、2011年9月和2013年1月至2月）对两个主要地点（圣城1号和圣城2号）进行了采样，额外的圣城3号仅在2013年2月进行采样，如下所述。1号站位于Randers峡湾（56u31912.2299N；10u13948.5999E），受其内部两条河流的淡水排放和高有机负荷的影响[21]。采样期间（2011年6月、9月和2013年1月），采样点的盐度范围为7%至9%。2号站位于奥胡斯Marselisborg Marina附近的卡特加特（56u08914.3299N；10u12955.1999E）。采样点非常靠近海岸线，采样期间（2011年7月、9月和2013年1月）盐度在16%到26%之间。2013年2月取样的3号站位于丹麦北�：０叮�57u0791299N；08u3791299E）汉斯霍姆港，盐度为35%。收集表层海水，通过250mm筛网过滤以去除较大的动物群，并在采样后3小时内将其装在干净的聚乙烯容器中运输至实验室。


在R/V Thompson（2012年3月和4月）上的ENTP春季巡航期间，该方法也被用作在东热带北太平洋（ETNP）氧气最低区（4号站，16u29993.2599N，109u59900.5999W）的船上试验。4号站距离墨西哥海岸约700公里（图S1）。海水样品用10 L Niskin瓶花环采集于110 m处，刚好低于氧气层。在该深度，通过使用STOX传感器的高分辨率原位氧气分析，发现无法检测到溶解氧[22]。取样后不久进行瓶培养，如下所示。


设置和实验


实验室培养实验在1160 mL的定制改良Schott Duran玻璃瓶中进行（图1）。一根25厘米长的玻璃管（内径0.25厘米）穿过瓶子一侧的玻璃壁。它用于压力补偿，以便温度-体积变化不会导致气泡形成和其他不良影响。一根更宽的玻璃管（内径0.8厘米）取代了原来的瓶颈，用于插入STOX氧传感器。瓶子内容物仅在毛细管顶部的水-空气界面处与空气接触（图1b），但由于该毛细管的内径较�。跗肫孔拥拇淇珊雎圆患疲峁糠郑TOX传感器的直径在8 mm瓶颈的0.1 mm范围内，因此与空气的接触仅限于0.3 cm距离内的超薄水层（图1 a）。由于STOX传感器和8毫米颈部之间的强毛细管作用，任何体积变化将仅在压力补偿管中可见。

图2。对照实验的结果（实验1）。显示了具有不同氧浓度的四个不同重复。添加64 h 1 mL空气，饱和0.05 M HCl，在毫质量水中，对应于244 nmol L-1 O2，用于传感器校准。内政部：10.1371/期刊。波内。0105399.g002


在实验过程中，瓶子被置于黑暗中，浸泡在恒温（15uC和21uC）的水浴中。使用2.5 cm长的玻璃涂层磁铁（Fisher Scientific）（图1 C）进行连续搅拌，同时将装有瓶子的容器置于磁搅拌器（IKA）顶部。


为了在测量氧气浓度时获得最高的相对分辨率，使用STOX传感器时，必须在低氧气浓度下工作。因此，通过使用混合有0.05%CO2的N2鼓泡来降低待研究水的O2浓度。


由于灌装过程中的空气污染，很难在瓶中获得非常低的O2浓度，但以下程序可使初始浓度降至约100 nmol-1。将待调查的水与N2混合0.05%CO2鼓泡约15分钟，同时将其封闭在一个10或20升的玻璃瓶中，该玻璃瓶只有一个小开口，以允许气体逸出。然后，使用带有泰贡管接头的玻璃管虹吸管从储液罐中注满瓶子，同时仍在冒泡。泰贡是首�。蛭喽圆煌秆跚彝该�，因此可以观察到不需要的气泡的存在。通过压力补偿管进行填充，同时通过插入8mm颈部的5mm泰贡管将惰性气体流保持在瓶子内。在保持气流和水流入的同时，将瓶子倒置，丢弃流入瓶子的前50-100毫升水；之后，瓶子被完全填满。然后立即插入STOX传感器，同时中断通过虹吸管的水流。


所有试验均在取样后30小时内进行，培养最长持续时间为20小时。所有玻璃器皿先在0.1 M NaOH中清洗，然后在0.1 M HCl中清洗，以避免有机污染。


对STOX方法进行了测试（实验1），并与丹麦沿�：拖客逅虻谋曜糤inkler技术进行了比较（实验2）；随后，将STOX方法应用于海洋水域，以评估ETNP OMZ中间深度的CR率（见表3）。


实验1-测试方法。氧内流和传感器稳定性的控制实验。在实验1中，上述设置用于评估方法的准确性和分辨率，以及检查外部和内部O2污染的可能来源。因此，用生物非活性水建立了一个对照实验，其中在4个重复瓶中监测O2浓度，该瓶中装有0.05 M HCl和软化水，软化水经过煮沸、冷却，然后用N2气体脱气至低O2水平（图2）。


实验2-方法在沿海水域的应用和比较。在实验2中，使用相同的设置和程序，在三个不同季节用STOX法测量了St.1、2和3的浮游生物群落呼吸率。为St.1、2和3设置一组平行培养瓶（n=3），以比较用STOX法（在低氧浓度下）获得的CR率与用Winkler滴定法在空气饱和时测得的呼吸率。此外，浮游生物群落的动力学参数由STOX方法获得的数据建模。对于空气饱和条件下的培养，重复上述相同的程序，但在这种情况下，用水轻轻地鼓入空气，并用实心玻璃棒更换STOX传感器以关闭瓶子。在孵育24小时之前和之后，通过Winkler滴定法在12 mL Exetainers（n=6）中采集氧气测定样品。按照Labasque等人[23]描述的程序，通过分光光度法测定O2浓度。


实验3-海洋水域中的方法应用。在实验3中，用STOX方法测量了太平洋St.4海洋样本的浮游生物群落呼吸速率（图S1）。


叶绿素a提取


对于每个站点，在开始瓶培养之前，通过Advantec GF-75玻璃纤维过滤器过滤1L海水，然后用96%乙醇提取色素，从取样水中提取叶绿素a[24]。测量分四次进行，叶绿素a浓度根据Lorenzen方法计算[25]。


传感器：原理、校准和电子学


STOX传感器是一种安培式氧传感器，具有就地零点校准的内置功能。该传感器由内部氧微传感器[26]组成，内部氧微传感器位于外部微传感器外壳内，外部微传感器外壳配有额外的硅膜。在两个膜之间，放置一个由多孔金制成的外阴极（前防护罩）。该前防护罩在20.8 V电压下的极化消耗了从外部介质扩散到测量传感器的所有氧气，导致现场零电流测定。随后前防护罩的去极化允许氧气通过并到达测量阴极。测得的电流差与氧浓度成正比。由于每个测量循环都记录了新的零点读数，因此该信号与零点漂移无关，并允许定义零O2浓度。零点测定的高精度允许非常高的低O2浓度分辨率，而在接近空气饱和的浓度下首选其他方法。与标准氧气微传感器相比，STOX传感器具有较高的搅拌灵敏度，且整个循环的响应时间相对较长（20秒至几分钟），因此，它们最适合在氧气浓度变化相对缓慢的搅拌介质中进行分析，如本文所述的瓶内培养。微传感器是按照前面的描述制造的[19,27]。在每次实验期间，通过向瓶子中注入已知体积的空气饱和水，对每个传感器进行校准。传感器连接到PA8000八通道皮安计（Unisense a/S，丹麦），而前防护的极化和去极化由定制的定时器控制开关箱调节，前防护的开启和关闭周期定时器设置为250秒。信号由Unisense ADC816 16位a/D转换器采集，该转换器使用Sensortrace Basic程序连接至便携式PC（Unisense a/S，丹麦）（图S2）。

图3。与沿�：Ｋ跤腟TOX传感器中氧气消耗的时间过程。来自站点2水孵化的STOX传感器数据示例（Marselisborg Marina，2011年9月）。仅绘制每个循环期间的最小和最大读数，并用线连接。最大和最小读数之间的差值用作O2浓度的测量值。信号的初始振幅（11 pA）对应于200 nmol-1瓶中的O2浓度。如红线所示，在1h（2ml，600nmol-1）和6.7h（4ml，1200nmol-1）注射空气饱和水。内政部：10.1371/期刊。波内。0105399.g003


动力学参数的数据分析与建模


在每组培养中连续记录氧气浓度，最长持续20小时。氧气消耗率通过氧气浓度随时间的线性回归计算得出。利用STOX方法获得的数据，通过离散O2间隔上的运行斜率计算斜率。对于高于6 mmol L-1的O2浓度，使用2 mmol L-1间隔，并且随着O2的减少，逐渐降低浓度范围。线性模型的拟合通过确定系数r2进行评估。


Michaelis-Menten方程的动力学参数Vmax（最大呼吸速率）和Km（表观半饱和常数）：

通过直接对每个复制的进度曲线（浓度与时间）进行非线性参数拟合来估计。数据符合方程（2），该方程描述了氧随时间的逐渐吸收[28]：

式中，C（t）是氧浓度随时间的函数，Co是所考虑间隔的初始浓度。Vmax和Km迭代变化，直到使用Excel中的解算器命令实现通过最小二乘法调整获得的最佳拟合[29]。


为了测试动力学参数是否随时间变化，在同一个瓶子中和几个实验中，通过在氧气浓度接近零时注入空气饱和水，测定了两次Km和Vmax值。


为了在模型和实验数据之间获得更好的拟合，k8凯发集团还测试了一个经验关系，该关系最初是为光合作用的光饱和曲线而建立的[30]。Jassby和Platt方法表示呼吸速率与氧浓度的关系如下：

其中a是低氧水平下曲线的初始斜率。为了使用半饱和常数（Km），对方程进行了修改，采用以下关系式，表示符合Michaelis-Menten动力学的速率-浓度曲线的初始斜率：

结合方程式3和4：

与使用Michaelis-Menten动力学类似，培养过程中氧浓度的时间演变符合以下方程式：

遵循与上述相同的迭代过程。