结果


地下水表征


2012年4月12日对ONK-PVA6和ONK-KR15地下水的地球化学进行了分析（表1）。所示的地下水参数比值表1表明，两种试验地下水类型仅在硫化合物含量上存在显着差异；否则，大多数其他参数最多相差2倍，这主要归因于ONK-KR15地下水的盐度高于ONK-PVA6地下水。2012年1月11日和4月17日对ONK-KR15地下水中的溶解气体成分进行了两次分析，2012年9月18日对ONK-PVA6地下水进行了一次分析（表2）。与ONK-PVA6地下水相比，ONK-KR15中含有更多的溶解气体，尤其是甲烷和氢气。


有1.8×10 4个细胞mL-1和4.5×10 3 amol ATP mL-1 2012年1月11日采样的OL-KR15的地下水中（表3）。NRB在MPN测定中占主导地位，只有NRB和MRB的MPN高于检测限。有4.9×10 4个细胞mL-1和1.06×10 4 amol ATP mL-1 2012年4月17日采样的OL-PVA6的地下水中（表3）。IRB和MRB主导MPN测定，NRB和SRB的MPN也高于检测限。


FCCS中的TNC、VLP和ATP


在细胞总数mL-1和ATP mL的量-1大部分实验时间内，FCCS之间的没有显着差异，但在所有三个系统中都有增加的趋势（图2a和b）。类似地，的ATP g量-1仅在硫酸盐+ONK-PVA6 FCCS中，岩石颗粒随时间显着不同（表4）。VLPs的数量在所有FCCS中大致恒定，每个细胞的VLPs数量在对照和硫酸盐FCCS中最高，而这个数量在硫酸盐+ONK-PVA6 FCCS中较低（图2c）。在剩余的实验时间内，每个细胞的VLP数量在大约40天后从平均20个显着减少到平均2-3个。每个细胞VLP的这种减少与TNC和ATP浓度的增加有关。噬菌体的裂解活性似乎随着时间的推移而降低，为增加未附着的生物量留出了空间。


表4.来自FC 2(岩石颗粒上的ATP n=3)和FC 4(n每个流动池循环系统中=3)的量

图2.(a)细胞总数(TNC)，(b)ATP浓度，(c)每细胞总数(TNC)中病毒样颗粒(VLP)的数量，以及(d)溶解甲烷的浓度在通过三个流通池柜循环的地下水中，补充有500 mL ONK-KR15地下水(?)、500 mL ONK-KR15地下水和1 mM NaSO 4(?)，以及500 mL ONK-PVA6地下水和1 mM NaSO 4（?）。条形表示±1标准偏差；n=3 in(a)–(b)。

FCCS中培养的微生物和有机酸


SRB的MPN增加到大约10 4个细胞mL-1在两种硫酸盐修正的FCCS中都并且中接近检测极限（即，0.2个细胞mL-1在缺乏硫酸盐的对照FCCS）（图3a）。NRB的MPN在硫酸盐+ONK-PVA6 FCCS中40天后最高（图3b）。在实验开始和结束时，所有三个FCCS都具有相似的NRB MPN。IRB的MPN随时间变化，在硫酸盐+ONK-PVA6 FCCS中最高（图3c）。同样，在所有FCCS的整个实验过程中，CHAB的数量大致相似，平均约为5×10 4细胞mL-1（图3d）。AA的MPN在对照系统中处于检测极限，增加至最多1-10 AA mL-1在硫酸盐修正系统中，并且在任何FCCS中均未产生乙酸盐。在所有FCCS的所有采样场合，HM的MPN均低于检测限。乙酸盐和DOC的浓度相对于采样时间0的起始值没有变化，分别为18μM乙酸盐和0.25μM DOC。


图3.(a)硫酸盐还原菌(SRB)的最可能数(MPN)，(b)硝酸盐还原菌(NRB)的MPN，(c)铁还原菌(IRB)的MPN，(d))可培养的异养需氧菌(CHAB)，(e)E h使用内部电极对测量的：四个电极信号的平均值（e中的蓝线），在硫酸盐流通池循环系统(FCCS)中（e中的红线），和在硫酸盐+ONK-PVA6 FCCS中（e中的绿线），以及(f)通过三个FCCS循环的地下水中的硫酸盐浓度，并辅以500 mL ONK-KR15地下水(?)、500 mL ONK-KR15地下水和1 mM NaSO 4(?)，以及500 mL ONK-PVA6地下水和1 mM NaSO 4(?)。

FCCS中的化学


甲烷浓度相对于起始值降低了大约15%（图2d）。硫酸盐+ONK-PVA6 FCCS中的甲烷较少，因为添加的ONK-PVA6地下水比ONK-KR15地下水含有更少的甲烷（表2）。pH在所有FCCS中以大致相同的速度下降，在103天后从大约8.2的起始值下降到大约7.5。的E h正如内部微电极所记录的那样，对照和硫酸盐FCCS在70天后下降到大约-250 mV的稳定水平（图3e）。的E h到实验结束时，硫酸盐+ONK-PVA6 FCCS缓慢下降至大约-100 mV。添加硫酸盐导致硫酸盐FCCS中的硫酸盐为1 mM，而硫酸盐+ONK-PVA6 FCCS中的浓度略高；这种差异是由于添加的ONK-PVA6地下水中的高硫酸盐浓度(1.9 mM)（图3f）。硫酸盐浓度在实验时间内没有变化，并且低于对照FCCS中的检测值。在所有采样情况下，所有FCCS中的硫化物浓度均低于检测值。在所有FCCS中，亚铁浓度增加到大约20μM。


MPN培养物的克隆和16S rDNA测序


从第82天和第103天接种的阳性NRB和SRB培养物的最高稀释液中提取的DNA被克隆和测序（表5）。序列数据揭示了来自研究的MPN培养物的总共八个克隆分类群。发现的序列代表了Deltaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria phyla。优势种属是Desulfovibrio aespoeensis和Pseudomonas stutzeri，分别有41和14个克隆观察结果；这些克隆与NCBI GenBank中的数据库记录有99.9-100%的相似性。


表5.在第82天和第103天从硫酸盐和硫酸盐+ONK-PVA6流通池循环系统采样的SRB和NRB MPN培养物克隆中检测到的分类群

地下水和生物膜提取中的DNA回收


提取的DNA总量为26至243×10-9 g（表6）。平均量的DNA的在一个典型的地下水细菌，例如，D.aespoeensis（Motamedi和Pedersen 1998），是649个道尔顿/碱基对×3629109个碱基（轨迹CP002431）=2.36×10 9道尔顿细胞-1=2.36×10 9道尔顿细胞-1×1.6605402×10-24 g道尔顿-1=3.9×10-15 g DNA细胞-1。从ONK-KR15中过滤了大约57 L的地下水，DNA回收率为63×10-9 g DNA（表6），这对应于1.62×10 7基于的DNA估计的平均大小的细胞D.aespoeensis。在有1.8×10 4个细胞mL-1过滤开始时，ONK-KR15地下水中（表3）。


表6.使用带有MXPro软件的Stratagene MX3005p荧光计和Molecular Probes的Quant-it Picogreen试剂盒进行荧光分析的提取双链DNA的量；在地下水和生物膜序列库中观察和估计的总OTU水平（>0%序列丰度）的多样性

计算出的平均DNA回收率变为1.6%。以同样的方式计算，ONK-PVA6地下水的DNA回收率为9.2%。在含水层排水过程中，深层地下水中的细胞数量趋于减少；如果发生这种情况，DNA回收率会更高，因为过滤过程中TNC的减少会增加观察到的DNA量，超过过滤器上捕获的细胞总数。对生物膜使用相同的公式表明大约有2×10 6个细胞（g岩石颗粒）-1，这比ATP分析表明的多，即大约5×10 5个细胞（g岩石颗粒）-1，假设平均0.4 AMOL每个细胞ATP（Eydal和Pedersen 2007）。无法确定ATP是否低估了生物量，或者游离dsDNA是否被噬菌体裂解的细胞或死吸附细胞吸附在岩石上。考虑到这些计算的输入数据具有相对较大的不确定性，三种不同的测定，即DNA、TNC和ATP，相当一致。


地下水16S rDNA v6v4序列多样性


除了11个Desulfosporosinus读数（=0.06%）外，ONK-KR15地下水的序列库中不存在与SRB相关的序列（表7）。在18134个读数中甚至没有发现其他SRB OTU的单例。稀少曲线表明每个样品捕获了90-95%的16S rDNA多样性。这一观察结果与可培养SRB的缺乏非常吻合（表3）。显性序列与氧化属密切相关氢Hydrogenophaga(30.3%)(Willems et al.1989)其次是假单胞菌-(8.8%)和硫杆菌-(8.6%)相关序列（图4）。


表7.来自生物膜和地下水的序列库中硫酸盐还原类群（Deltaproteobacteria和Firmicutes）的出现率≥0.1%，并观察到库中的主要OTU及其在GenBank核酸数据库中报告的样本位点

图4.ONKALO地下水和FCCS生物膜样品的v4v6热标签测序文库的组成。显示了频率丰度≥1%的序列。酒吧名称：KR15=ONK-KR15地下水采样于2012年4月17日；bf 0=第0天的生物膜；bf C=第103天的对照生物膜；bf S=第103天的硫酸盐生物膜；bf S 6=第103天的硫酸盐+ONK-PVA6生物膜；PVA6=2012年4月17日采样的ONK-PVA6地下水。不适用：未注释。条形图上方的树描绘了Morisita-Horn距离度量，该度量使用具有算术平均值(UPGMA)的未加权对组方法构建，并具有物种级别的分类深度。比例尺代表5%的核苷酸取代。

古细菌由与Euryarchaeota和Thermoplasmata(3.5%)相关的序列代表，后者序列先前已在南非深部金矿的样本中描述过(Gihring等人2006）。与来自ONK-KR15地下水的序列库不同，来自ONK-PVA6地下水的序列库以454个与SRB属或科相关的序列为主以Desulfobacula（33.3%）和Desulfobulbaceae，分别（23.2%）为代表（图4）。ONK-KR15的三个最丰富的序列也在一定程度上在ONK-PVA6序列库中被发现。ONK-PVA6和ONK-KR15序列库中相似序列的发生率是合理的，因为水文模型表明含有SRB的中等深度、富含硫酸盐的地下水向下渗透并与含水层区域的深层、贫硫酸盐地下水混合ONK-PVA6所连接的(Aalto et al.2011）。


生物膜16S rDNA v6v4序列多样性


在生物膜样品中观察到明显的系统发育相似性，并且每个FCCS处理的多样性特征表明相对于第0天的生物膜多样性在103 d内几乎没有变化（图4）。在ONK-KR15地下水中发现的许多OTU也在FC生物膜中发现。然而，一些属似乎更喜欢浮游状态，因为它们在生物膜中没有被发现或以非常低的频率被发现。与Fusibacter、Thermoplasmata和Nitrospira在生物膜序列库中未发现OTU相关的序列。其他的，如Brevundimonas水库OTU，在生物膜中的含量是地下中的10倍。


否则，在地下水中发现的大多数OTU在所有生物膜样本中也以通�？杀冉系钠德史岫人承虮硎尽５腍ydrogenophaga，Lutibacter，和假单胞菌属的OTU一起构成大部分的序列读数在>50％的序列丰度所有生物膜样品中和构成的序列的45％ONK-KR15地下水读取。生物膜多样性似乎构成了地下水多样性的良好预测指标，反之亦然。


SRB在硫酸盐修正的FCCS中的MPN为5000个细胞mL-1在第103天（图3a），通过克隆表明为D.aespoeensis（表5），而对照低于检测值（<0.2个细胞mL-1)。序列数据与此一致，只有11个与相关的读数脱硫球茎在第103天，控制生物膜文库中，而硫酸盐生物膜文库共有218个与SRB相关的读数，其中168个（0.81%）与SRB相关。D.aespoeensis。硫酸盐+ONKPVA6生物膜文库同样包含与SRB相关的211个读数，其中43个与D.aespoeensis相关，22个与Desulfobacula OTU相关。中给出了SRB频率丰度的详细信息表7。


在硫酸盐和甲烷梯度相反的情况下，地下微生物群落的多样性受硫酸盐控制——摘要、介绍

在硫酸盐和甲烷梯度相反的情况下，地下微生物群落的多样性受硫酸盐控制——材料和方法

在硫酸盐和甲烷梯度相反的情况下，地下微生物群落的多样性受硫酸盐控制——结果

在硫酸盐和甲烷梯度相反的情况下，地下微生物群落的多样性受硫酸盐控制——讨论、致谢！