讨论


如引言中所述，两种主要的水文地球化学类型的地下水在O ki u t深度分层，被深度介于250和350 m之间的混合层隔开。因此，这种随深度的变化为微生物多样性和活动提供了截然不同的地球化学环境。这些层的454个序列多样性差异很大，ONK-PVA6地下水库中大多数与RB相关的序列代表混合层（表6）。这与可培养微生物的结果（表3）以及之前关于混合层中硫酸盐显着还原为硫化物的观察结果一致（P d s n等，2008）。相比之下，注入ONK-KR15的深层地下水系统呈现“沙漠状”，可培养细胞的多样性非常低，即只有兼性厌氧菌具有硝酸盐还原能力（表3）。


值得注意的是，没有硫酸盐似乎从ONK-KR15地下水和生物膜序列库中排除了RB相关序列。然而，的物种丰富度（即分类单元数&t;0%）和计算的序列多样性指数（表6 ONK-KR15）略高于ONK-PVA6地下水。ONK-KR15序列库中最丰富的序列与潜在的自养、利用属有关氢的Hyd n p（Wi ms等人，1989）和假单胞菌属，硫杆菌属，和Fusib t（R v t等人，1999年）。用于培养的培养基没有补充这些属所使用的电子供体和受体，如氢和硫代硫酸盐，这可能有利于它们的生长。鉴于这些新结果，现在可以重新设计培养基以增加可培养微生物的种类。由于针对PCR引物古细菌的在该分析中未使用，因此分析ONKALO地下水中古细菌的完整多样性的任务仍然存在。


观察到的序列多样性


在103天的实验时间和两次处理中，生物膜的多样性变化很�。ㄍ�4）。OTU序列的比对分析以&t;3%的丰度出现，表明它们在地下水和所有四种生物膜样品之间是相同的，除了Hyd n p序列，样品之间的OTU组成有所不同。类似地，作为ATP分析的生物量（表4）和生物膜多样性在103天后几乎没有变化，这意味着ONK-KR15生物膜的多样性水平恒定。生物膜经过处理和时间的可重复454热标签测序结果清楚地证明了DNA提取和454热标签测序方法的可重复性和稳健性，其中每个生物膜都可以被视为独立的测序样本。


观察到的独特OTU的数量在108-135个范围内（表6），比以前在K i发现的更多（i in t.2006）和芬诺斯堪底亚盾（P d s n等人。1996年,1997)使用克隆和测序的地下水，但比使用454热标签测序在冰下水（即208-410个OTU；M t inss n等人2013），比深的海水中发现的（少了10次in等人。2006）。观察到的454个序列与报告给nB nk的k8凯发集团、盐沼、地下水、污泥和湖水的序列大致相当（表7）。然而，尽管相似性接近100%，但B st结果过于多样化，无法得出关于从ONKALO观察到的OTU的全球站点特异性的结论。


O ki u t的深层盐水和微碱性地下水可能受到更深的超镁铁质环境的影响，并持续蛇纹石化，这可以解释观察到的非常高浓度的甲烷和氢气（w d L等人，1993).这样地下环境似乎丰富Hyd n p别处（·布拉泽尔顿博士等人的2013）。在ONK-KR15的情况下提出了类似的富集，因为该属在454序列库中占主导地位。少数百分比的古细菌数据集中序列与来自南非金矿深部含盐地下水的T m p sm t序列有关（i in等人，2007年）。2006；高井等人。2001）。的主导地位Hyd n p OTU表明，深部地下生命的多样性受环境参数控制，这些环境参数调节具有相关生理和代谢能力的各种属的生长和活动。主要的相关参数是各种碳和电子供体和电子受体的存在与否。


硫酸盐对RB多样性和活性的影响


ONK-KR15和ONK-PVA6地下水在地球化学上的唯一主要区别是ONK-KR15地下水中不含硫酸盐和硫化物（表1）。这种差异极大地影响了观察到的可培养RB数量和RB的16 DNA多样性，这在ONK-PVA6地下水中很大，而在ONK-KR15中几乎不存在（图4、表3和7）。由于硫酸盐是混合层中主要的可用电子受体，甲烷可能是硫酸盐还原的最大电子供体，其浓度是第二大潜在电子供体DOC的10倍（表1表和2）。然而，与甲烷不同，如果被微生物氧化，可以通过扩散和地下水运动从富含甲烷的深层层不断补充，DOC必须通过化学或光自养代谢过程合成。


在之前的一项研究中，在装有ONK-PVA6地下水的FCC中观察到最多产生320μM的醋酸盐，推测醋酸盐是由使用甲烷作为碳源的微生物产生的（P d s n 2013）。几个在ONK-PVA6（所述RB的表7）被称为完整乙氧化属，即，D su f b t ium（B ys等人1987），D su f b u，和D su f ti num（Ku v等。2001）。因此，与乙酸盐的存在及其可能从甲烷中产生的结果一致，目前和以前的结果表明，中深层富含硫酸盐和深层富含甲烷的地下水的混合诱导了使用甲烷和乙酸盐作为硫酸盐还原微生物群落ONK-PVA6含水层中的关键电子和碳供体。


ONKALO隧道的建设导致富含硫酸盐的地下水与深层富含甲烷的地下水混合。已经发现，混合层在与ONKALO隧道相交的裂缝中缓慢移动到更深处。ONK-PVA6钻孔于2009年11月3日至4日钻孔，当时地下水缺乏硫酸盐。截至2012年4月12日，由于水位下降，硫酸盐浓度自那时起缓慢上升至1.9 mM。此处报告的FCC实验旨在模拟这种人类引起的地下水地球化学转变，该转变正在缓慢深入在ONKALO中，触发混合层中的RB生长。具有硫酸盐还原能力的序列和培养物以相似的比例出现在富含硫酸盐的FCC的地下水和生物膜中，即大约占细胞和序列总数的1%（表1和7）。因此，硫酸盐是导致ONK-KR15地下水中RB生长所需的唯一化合物。添加ONK-PVA6地下水对序列多样性和可培养微生物数量的影响很小。


ONK-PVA6地下水具有代表序列D su f bu的，这是一种在硫酸盐+ONK-PVA6生物膜中发现的OTU，但在硫酸盐生物膜中没有。否则，两种处理没有显着差异。硫酸盐作用缓慢，可培养RB的MPN增加需要60 d以上（图3）。这与E的时间一致硫酸盐FCC中接近–250 mV，这是一个典型的E，之前在FCC中观察到RB活动（P d s n 2012b）。虽然在对照生物膜454序列库中没有检测到RB相关序列，但在稀有生物圈中可能仍然存在一些RB属的细胞（in等人2006)硫酸盐处理后可以生长的FCC。因此，FCC实验证实了以下假设：硫酸盐是在O ki u t缺乏硫酸盐的深层地下水中引起RB生长所需的唯一化合物。


高k米为37毫米的甲烷已被报道用于甲烷（AOM）处理的k8凯发集团中的厌氧氧化（Z n等人2010）。如果甲烷是RB群落的主要电子供体，观察到的细胞数量缓慢增加和硫酸盐修正FCC序列库中RB相关OTU的有限代表可能如此高K m与硫酸盐AOM的有关.因此，尽管硫酸盐修正的FCC中可能一直在使用硫酸盐AOM，但该过程可能太慢，无法在大约4.5 mM的表观甲烷浓度下进行检测。


病毒（即攻击地下水中微生物的噬菌体）的存在必须源自宿主微生物的裂解感染。A PO硬岩实验室地下水噬菌体丰富的调查返回大量多样化的噬菌体人口（凯尔等人。2008年）。VLP与TNC的平均比率为12，表明微生物种群活跃。如果深层地下水中的噬菌体具有活性和裂解性，它们将构成可能控制微生物数量和活动的重要捕食者群体。此外，它们的存在表明它们的猎物——微生物——是活跃的并且正在生长。VLP与TNC的比例在实验的前半部分很高，之后下降到2-4（图1）。这种减少与硫酸盐修正的FCC中NRB和RB的增加相吻合（图2和b)。似乎噬菌体最初对FCC中的微生物细胞（尤其是RB）的数量产生了显着的控制作用。


总之，这项工作证明了深层地下水组成与微生物多样性之间存在明显的关系。地下水中仅存在/不存在一种地球化学参数，即硫酸盐，导致了非常大的群落转变。因此，研究的地下微生物群落有能力通过表现群落转变来响应地球化学环境的变化。培养和454热标签测序均表明RB群落在存在硫酸盐的深层生物圈中非常具有竞争力。由于RB活动会产生对金属具有腐蚀性的硫化物，因此在评估微生物过程对未来金属罐中放射性废物地质处置的影响时，应考虑这些结论。


致谢


由阿尔弗雷德P.斯隆基金会支持的深碳天文台深生命普查计划使热标签测序数据成为可能。Py t测序是在海洋生物实验室（美国马萨诸塞州伍兹霍尔）进行的，凯发k8国际首页登录在那里得到了n im、Hi y M is n、us n Hus、Mit in、J s p Vin is和And w V is的大力帮助。M it Y i-K i在ONKALO站点的协助是一流的，不可或缺的。作者感谢瑞典微生物分析的Bj?n H b k、J ssi J nss n和Lind J nss n，感谢他们出色的实验室工作。


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